Modellazione e ottimizzazione dello smistamento immunomagnetico parallelizzato di nanopori per l'isolamento specifico dei marcatori di superficie di vescicole extracellulari da mezzi complessi

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13292 (2023) Citare questo articolo

391 accessi

1 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

L'isolamento di sottopopolazioni specifiche di vescicole extracellulari (EV) in base alla loro espressione di marcatori di superficie rappresenta una sfida significativa a causa delle loro dimensioni su scala nanometrica (<800 nm), della loro espressione eterogenea di marcatori di superficie e del vasto numero di EV di fondo presenti nei campioni clinici (1010–1012 EV/mL nel sangue). Lo smistamento nanomagnetico altamente parallelizzato utilizzando chip TENPO (track etched magnetic nanopore) ha ottenuto uno smistamento immunospecifico preciso con elevata produttività e resilienza all'intasamento. Tuttavia, non è stato ancora effettuato uno studio sistematico dei parametri di progettazione che controllano i compromessi in termini di produttività, obiettivo di recupero dei veicoli elettrici e capacità di scartare i veicoli elettrici di fondo in questo approccio. Combiniamo la simulazione degli elementi finiti e la caratterizzazione sperimentale dei chip TENPO per chiarire le regole di progettazione per isolare le sottopopolazioni di EV dal sangue. Dimostriamo l'utilità di questo approccio riducendo lo sfondo del dispositivo> 10 volte rispetto ai progetti pubblicati in precedenza senza sacrificare il recupero degli EV target selezionando il diametro dei pori, il numero di membrane posizionate in serie e la portata. Confrontiamo i veicoli elettrici isolati con TENPO con quelli dei metodi gold standard di isolamento dei veicoli elettrici e dimostriamo la sua utilità per un'ampia applicazione e modularità prendendo di mira sottopopolazioni di veicoli elettrici provenienti da più modelli di malattia tra cui cancro ai polmoni, cancro al pancreas e cancro al fegato.

Le vescicole extracellulari (EV) sono particelle membranose su scala nanometrica (< 800 nm) contenenti carichi di acido nucleico ed esprimono proteine di superficie che riflettono le loro cellule di origine1. A causa dei loro molteplici carichi e della loro capacità di aggirare le barriere anatomiche come la barriera emato-encefalica per circolare nei fluidi corporei periferici come il sangue (1010-1012 EV/mL)2 e l'urina (1010 EV/mL)3, gli EV sono diventati una promettente fonte di biomarcatori per la diagnosi e la caratterizzazione di molteplici tumori4,5,6,7,8,9, nonché in altri contesti patologici tra cui lesioni cerebrali traumatiche10 e malattie infettive11. Inoltre, i veicoli elettrici svolgono un ruolo meccanicistico nei processi biologici come la semina metastatica12 e le interazioni tumore-immunità nel cancro13, nonché in patologie tra cui lesioni cerebrali traumatiche14, malattie autoimmuni15 e arresto cardiaco16.

Attualmente, lo studio dei veicoli elettrici e il loro potenziale diagnostico e terapeutico sono frenati da una tecnologia che non è stata progettata per affrontare la loro combinazione unica di dimensioni su scala nanometrica, complessità e quantità nei campioni biologici. L’elevata concentrazione di EV nel sangue rappresenta una sfida particolare per i ricercatori che cercano di differenziare una specifica sottopopolazione di EV da altre sottopopolazioni di EV, così come altre particelle non-EV come detriti cellulari nella stessa gamma di dimensioni (“fondo”) non rilevante. . Gli attuali metodi di isolamento dei veicoli elettrici standard di riferimento come l'ultracentrifugazione, i kit di precipitazione commerciali (Thermo Fisher, System Biosciences) e la cromatografia ad esclusione dimensionale non hanno la selettività dei marcatori di superficie e la produttività per ordinare con precisione le sottopopolazioni di veicoli elettrici17.

Allo stesso modo, i metodi precedentemente stabiliti per lo smistamento dei marcatori di superficie delle cellule non sono in grado di misurare gli EV su scala nanometrica o di raggiungere la produttività necessaria per elaborare il gran numero di EV tipicamente presenti nei campioni clinici. Ad esempio, l'elaborazione di ~ 1011 EV in 1 ml di sangue non sarebbe fattibile per la citometria a flusso cellulare ad alto rendimento. I tipici citometri a flusso di nanoparticelle selezionano a una velocità di ~ 1.000 conteggi/secondo18, richiedendo circa 3 anni per selezionare 1 ml di sangue, mentre anche i più recenti sistemi di citometria a flusso subcellulare che selezionano a ~ 60.000 eventi/secondo19 richiederebbero 19 giorni per 1 ml di sangue. sangue. Questa sfida è amplificata dalla bassa espressione assoluta delle proteine di superficie sugli EV rispetto alle cellule a causa dell'area superficiale notevolmente aumentata di una cellula di ~ 10 µm rispetto a un EV < 800 nm, producendo così segnali fluorescenti al di sotto del livello di rilevamento per sistemi di citometria a flusso commerciali20. In risposta a questa sfida, sono stati sviluppati molteplici approcci microfluidici utilizzando dimensioni di elementi su micro/nanoscala di dimensioni EV per eseguire lo smistamento EV di precisione basato sulle dimensioni o su marcatori di superficie. Tuttavia, limitazioni come il requisito della nanofabbricazione complessa4,21,22, volumi di input massimi bassi23,24, la dipendenza da un singolo target di biomarcatore molecolare25 o una bassa produttività del campione21 hanno ostacolato l'applicabilità della dimensione microfluidica o dell'ordinamento EV dei marcatori di superficie.

107 pores/cm2 for d = 600 nm pores5, > 106 for d = 3 µm pores per Cytiva/Whatman). Lastly, track etching combined with vapor deposition of a bilayer, consisting of a soft magnetic layer of NiFe and a passivation layer of Au, offers inexpensive fabrication of large numbers of precisely-defined magnetic nanopores while bypassing expensive and difficult-to-scale lithography5./p> 10% of the magnetic nanopores become occluded. This feature arises because the fluidic resistance of the magnetic nanopores is several orders of magnitude greater than the resistance between pores, and as such when a pore is occluded the flow is distributed not only to its nearest neighbors, but uniformly over the entire 107 pores as if they are in connected in a parallel circuit27. Moreover, in many applications of isolating specific sub-populations of EVs, the subpopulation is sparse (ex. ~ 1900 tumor-derived EVs/mL per mm3 of tumor volume for highly-shedding tumors)28 in comparison to the total number of EVs. Therefore even in a case when TENPO processes 1011 EVs in a mL of human plasma, several orders of magnitude less targeted EVs are captured on the TENPO’s ~ 107 magnetic nanopores. Because our device sorts EVs one at a time, in a device that is matched in scale to that of nanoscale EVs, it can sort EVs based on quantitative expression of surface markers, akin to flow cytometry for cell based sorting. This is in contrast to conventional methods that use micrometer-scale sized beads or devices29, where EV capture is dictated by a single binding event. Moreover, previous immunoaffinity bead isolation methods have been limited by the requirement that a high proportion of EVs express a given target protein30./p>

2.5 mL/h, Rs decreased as a function of flow rate ɸ. At flow rates ɸ < 2.5 mL/h, 1-Rw increased as a function of ɸ, and beyond ɸ > 2.5 mL/h, all weakly targeted EVs were successfully discarded. (Fig. 2C). This model system demonstrates the potential for tuning the tradeoff between Rs and 1-Rw in this model scenario featuring both targeted EVs and off-target EVs with non-specifically bound MNPs./p> 33)./p> 10 mL/h rather than decreasing (Fig. 3C, SI Fig. 11). This difference may be due to differences in magnetic labeling where EVs with greater than 15 MNPs are still captured at high flow rates. We observed no change in isotype-labeled EV RNA at any of the flow rates, in contrast to the predicted decrease in background on simulation. As in the membrane number scan, we hypothesize that the isotype background Cq values are closer to the limit of detection of our PCR assays. We observed the greatest difference between the antibody-labeled versus isotype-labeled EVs at a flow rate of ɸ = 2.5 mL/h (Fig. 3C, SI Fig. 11)./p> .05), while for GAPDH there was a significant difference between the antibody replicates (p = .014) but not the isotype replicates (p > .05)./p> 1000) of clinical samples are required. By virtue of its low construction/operation cost (cost for one pan-EV prototype TENPO assay = ~ $35; $12 material/fabrication5, $5 antibody, $18 beads) and compatibility with roll-to-roll manufacturing, TENPO could be scaled up to fast chip manufacturing while also having the throughput for large clinical cohorts. The fabrication cost of TENPO is invariant to pore diameter, unlike most microfluidic approaches which rely on lithographic fabrication. Previous work in our group with TENPO using 600 nm pores to isolate EV subpopulations was able to yield clinically-relevant diagnostic information in n = 204 pancreatic cancer samples6 as well as in n = 96 traumatic brain injury samples10. In these cases, TENPO using 600 nm pores was able to distinguish biological nucleic acid signals from background, which can be improved even further with the 10× improvement in specificity versus isotype background suggested in this manuscript./p>

~ 3 × 109 EVs for pancreatic cancer, 1 mL—> ~ 9 × 1010 for lung cancer, 1 mL—> ~ 9 × 108 for liver cancer) into healthy human plasma (0.75 mL healthy human plasma for pancreatic cancer, 0.25 mL healthy human plasma for lung and liver cancer; plasma has an EV concentration of 2 × 1012 EVs/mL as measured via NTA). Equivalent volumes of non-conditioned clean culture media (media not exposed to cancer cells) were added to the volumes of healthy human plasma stated for each cancer media type to make the “healthy” samples./p>